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人猿超科和旧大陆猴7种高等灵长类FKN全基因序列的测定及进化
浏览次数:1865  发布时间:2010-10-27  返回

洪晓武1,张亚平2,储以微1,高海峰1,蒋正刚1,熊思东1
1.复旦大学上海医学院免疫学系、免疫生物学研究所,上海 200032;
2.中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化开放实验室,昆明 650223

摘要:测定人猿超科(人、黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩和长臂猿)和旧大陆猴(猕猴和叶猴)7种高等灵长类FKN全基因序列,探讨其系统进化分析。用简并引物PCR(Degenerated PCR)法分别扩增FKN的3个外显子,其产物经琼脂糖凝胶回收、纯化后测序,然后用BioEdit软件剪切拼接FKN基因全序列,用DNAStar比对后比较基因和氨基酸序列同源性,Mega软件重构FKN基因进化树,应用Datamonkey分析FKN的负选择位点。序列分析发现人猿超科较旧大陆猴FKN基因除了有散在的点突变外,还有一明显的30bp的核苷酸缺失突变;人FKN基因序列与黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、长臂猿、猕猴和叶猴的同源性分别是99.2%、98.4%、98.1%、96.5%、95.9%和93.8%,由此推导的氨基酸序列同源性分别是98.5%、98.0%、97.7%、94.7%、93.7%和90.5%;FKN基因进化树表明人与黑猩猩关系更近,FKN基因进化和通常认为的物种进化一致;Datamonkey分析结果显示FKN存在3个负选择位点53Q、84D、239N。成功获得人、黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、长臂猿、猕猴和叶猴7种高等灵长类物种FKN全基因序列,为后续探讨FKN在高等灵长类物种进化过程中免疫学功能演变及其结构与功能的关系奠定基础。
关键词:人猿超科;旧大陆猴;FKN;测序;进化分析

Complete sequence determination and phylogenetic analysis of FKN among seven higher primates including homonids and Old World Monkeys
HONG Xiao-Wu1, ZHANG Ya-Ping2, CHU Yi-Wei1, GAO Hai-Feng1, JIANG Zheng-Gang1, XIONG Si-Dong1
1.Department of Immunology,Shanghai Medical College, Institute for Immunobiology, Fudan University, Shanghai 200032, China;
2.Laboratory of Cellular and Molecular Evolution, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China

Abstract:To obtain full-length FKN nucleotide sequences of homonids, including human, chimpanzee, gorilla, orangutan and gibbon and Old World Monkeys, including macaque and leaf monkey and make phylogenetic analysis. Three exons of FKN were amplified by degenerated PCR using obtained human peripheral blood cells DNA as template which was extracted from homonids and Old World Monkeys. After extracting and purifying from agarose gels, PCR products were sequenced and then spliced by using BioEdit. All the FKN sequences were aligned and compared the percent identity by using DNAStar. The phylogenetic tree was constructed using maximum evolution approach in Mega. The negative selection sites were analyzed by using Datamonkey. There is an apparent 30 bp nucleotides deletion mutation in homonids FKN comparing to that of Old World Monkeys besides other point mutations. Homology of nucleotide sequence between human and chimpanzee, gorilla, orangutan, gibbon, macaque and leaf monkey is 99.2%、98.4%、98.1%、96.5%、95.9% and 93.8% respectively. Homology of amino acid sequence of them is 98.5%、98.0%、97.7%、94.7%、93.7% and 90.5% respectively. In the same time, the genealogical relationship of human is a lot closer to chimpanzee than it is to gorilla and other apes, the evolution rule of FKN gene is in accord with that of the higher primates. In addition, Datamonkey shows that there are 3 negative selection sites, 53Q, 84D and 239N in FKN. The full-length FKN gene of human, chimpanzee, gorilla, orangutan, gibbon, macaque and leaf monkey were sequenced successfully, and the FKN sequences analysis lays the foundation for further studying its evolution in immunological function in higher primates and the relation between its structure and function.
Keywords:homonids; Old World Monkeys; FKN; sequence; phylogenetic analysis


《遗传》2008年第30卷第5期即将发表。图表及参考文献省略。
收稿日期:2007-10-23; 修回日期:2008-02-18
基金项目:国家自然科学基金(编号:30700737);复旦大学上海医学院青年科学基金(编号:06J-1)资助
[Supported by National Natural Science Foundation of China (No.30700737) and Program of Young Science Fund of Shanghai Medical College,Fudan University (No.06J-1)]
作者简介:洪晓武(1975-), 男, 汉族, 安徽绩溪人, 讲师, 博士, 研究方向:分子免疫学。Tel:021-54237362, Email:xiaowuhong@fudan.edu.cn
通讯作者:张亚平(1965-), 男, 汉族, 云南昭通人, 教授, 博士, 研究方向:分子进化学。Tel:0871-5190761, Email:zhangyp@mail.kiz.ac.cn;
熊思东(1962-), 男, 汉族, 江西南昌人, 教授, 博士, 研究方向:分子免疫学。Tel:021-54237749, Email:sdxiong@shmu.edu.cn

灵长类的系统发育一直是进化研究的热点之一,但由于缺乏完整的化石记录,迄今为止仍然存在许多争议,例如关于人猿超科内部人、黑猩猩和大猩猩之间的关系,目前多数结论认为人与黑猩猩关系更近,但也有其他观点认为人与大猩猩的关系近于与黑猩猩的关系或者认为黑猩猩与大猩猩关系更近。因此,对这一问题尚无完全一致的结论。从核基因组序列进行分子水平的研究,对于阐明这一问题必不可少。
趋化因子Fractalkine(FKN)是迄今为止发现的唯一的CX3C(δ)型成员,也是第一个发现的以分泌型和膜结合型两种形式同时存在的趋化因子,在人心、脑、肾脏、结肠、前列腺、心肌、骨骼肌、神经元及DC等多种组织和细胞上均广泛表达,同时FKN也广泛表达在非人高等灵长类物种。
FKN以其独特的分子结构和存在形式成为研究的热点,但主要集中在其免疫功能方面:包括介导细胞迁移及以不依赖选择素和整合素的方式捕获或吸引白细胞紧密粘附,参与免疫炎症反应;参与细胞间信息传递,促进正常免疫细胞的成熟和分化;抑制Fas-FasL诱导的细胞凋亡;保护和促进中枢神经系统的小胶质细胞的生存。
Shall T 认为,FKN在白细胞迁移过程中发挥着关键作用,反映了一种进化上的需要。但迄今尚未见FKN基因在系统进化分析方面的报道。此外,从FKN基因进化过程预测在其介导的免疫学功能中起关键作用的氨基酸位点,目前也没有报道。
基于此,本文着重于测定人猿超科和旧大陆猴7种高等灵长类FKN全基因序列,对序列进行了核苷酸、氨基酸水平的比较,重构FKN基因进化树,并预测FKN的负选择位点,这为后续探讨FKN在高等灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变奠定基础,同时也为研究FKN结构与功能的关系提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 标本

人猿超科(Homonids):人(Human,Homo sapiens)、黑猩猩(Chimpanzee,Pan troglodytes)、大猩猩(Gorilla,Gorilla gorilla)、红毛猩猩(Orangutan,Pongo pygmaeus)和长臂猿(Gibbon,Hylobates lar);旧大陆猴(Old World Monkeys,OWMs):弥猴(Macaque,Macaca assamensis)和叶猴(Leaf Monkey,Presbytis francoisi)7种高级灵长类物种外周血标本由中国科学院昆明动物研究所提供。

1.2 基因组DNA的制备、PCR和测序

采集7种高等灵长类物种外周血各2 mL,按基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa Biotech)说明书提取DNA。按照UCSC(http://genome.ucsc.edu)上对人FKN基因Blat结果设计简并引物。PCR反应的总体积为50 μL,其中基因组DNA约20 ng,10×ExTaq缓冲液5 μL,10 pmol/μL dNTPs 4 μL,ExTaqTM 0.25 U,10 pmol/μL的引物各1 μL,加灭菌的去离子水至50 μL。PCR反应程序为:95℃ 1 min;94℃ 30 s,55~60℃(依照不同模板不同引物有所变化)30 s,72℃ 45 s,35个循环;72℃ 10 min。取2 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,回收产物(Watson Biotech试剂盒)并纯化后,在ABI 3700型自动测序仪上进行核苷酸序列测序。

1.3 基因序列比对、同源性比较与基因进化树、负选择位点分析

首先将测序获得的序列用Seqman进行正反链拼接并转换成seq文件,然后用Clustal W把3个不同的外显子分别进行排序,接着用Bioedit剪切掉引物和其他非编码区序列,随后依次将外显子1,2和3基因序列串接形成完整的FKN序列,先用MegAlign进行比对分析,然后比较FKN基因和氨基酸序列同源性,用Mega软件的ME法重构FKN基因进化树,应用Datamonkey(http://www.datamonkey.org/)分析FKN的负选择位点。

2 结 果

2.1 外显子扩增

分别用简并引物扩增FKN的外显子1,2和3,然后用1.5%琼脂糖凝胶电泳,得到相应的电泳条带。

2.2 测序和比对

将人猿超科和旧大陆猴7种高等灵长类FKN基因各自3个外显子分别进行双向测序,每个物种用3个样本,每个样本测序3次,对旧大陆猴和人猿超科FKN基因全序列比较的结果显示:除了有散在的点突变外,还发现人猿超科较旧大陆猴FKN基因在粘蛋白样区有一明显30bp核苷酸缺失。

2.3 同源性比较与基因进化树、负选择位点分析

将所得的人猿超科和旧大陆猴7种高等灵长类FKN全基因序列及其推导氨基酸序列进行比较,结果显示:人FKN基因序列与黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、长臂猿、弥猴和叶猴的同源性分别是99.2%、98.4%、98.1%、96.5%、95.9%和93.8%,由此推导的氨基酸序列同源性分别是98.5%、98.0%、97.7%、94.7%、93.7%和90.5%。FKN基因进化树表明人与黑猩猩关系更近,FKN基因进化和通常认为的物种进化一致。Datamonkey分析结果显示FKN存在3个负选择位点53Q、84D、239N。

3 讨 论

FKN mRNA主要表达在脑组织等实质脏器,而在外周血没有mRNA的表达,仅存在基因组DNA,由于高级灵长类物种实体组织标本来源困难,很难通过RT-PCR的方法获得其全基因测序,因此我们考虑用基因组DNA为模板对FKN的3个外显子进行分段扩增,然后进行测序、拼接。基于此,我们抽提了人猿超科和旧大陆猴7种高等灵长类外周血基因组DNA,用人FKN基因序列在http://genome.ucsc.edu上对人基因组做Blat后设计简并引物进行PCR,然后用纯化的PCR产物进行测序,每个物种用3个样本,每个样本分别双向测序3次,保证了结果的真实性和客观性。
本研究系统比较了人猿超科和旧大陆猴7种高等灵长类FKN的全基因信息,结果显示人猿超科较旧大陆猴FKN基因除了有散在的点突变外,在粘蛋白样区尚有一明显的30bp核苷酸缺失,且并不影响基因的“阅读框架”(ORF, open reading frame)。基因的缺失突变大多与疾病有关,因此该缺失片段对FKN功能影响是一个值得关注的问题,Fong AM等研究表明:FKN的CX3C趋化功能区独自承担结合其受体CX3CR1的任务而发挥趋化作用,但单纯的CX3C趋化功能区对表达CX3CR1的细胞无粘附作用,必需既有CX3C趋化功能区又有粘蛋白样区才有粘附作用。因此,这段缺失突变很可能会影响FKN的粘附作用。
人FKN基因序列与黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、长臂猿、弥猴和叶猴的同源性分别是99.2%、98.4%、98.1%、96.5%、95.9%和93.8%,由此推导的氨基酸序列同源性分别是98.5%、98.0%、97.7%、94.7%、93.7%和90.5%,这说明人与非人高等灵长类物种FKN基因具有很高的同源性,FKN基因进化树表明人与黑猩猩关系更近,FKN基因进化和通常认为的物种进化一致,这些提示FKN在高等灵长类物种中可能发挥相似的生物学功能,但随着物种的不断进化,FKN基因的生物学功能有可能发生演变,这种演变可能主要体现在效应的强弱上。Datamonkey分析结果显示FKN存在3个负选择位点53Q、84D、239N,按照进化生物学理论,负选择位点一般是极其保守的,对于基因功能的维持是极其重要的,例如对蛋白质结构维持的位点一般都是负选择位点。一旦负选择位点发生突变,就会被净化处理,从而消失,这提示FKN的53Q、84D、239N氨基酸位点可能在FKN介导的趋化、黏附等免疫学功能维持中起着非常重要的作用。

本研究的发现将为后续研究FKN基因的进化和免疫学功能演变关系提供良好的理论和实验基础,同时也为研究FKN结构与功能的关系提供一个新的视点。
 

 
 
 
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